1 請問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時(shí)，促凝的(de)是(shì)TEMED還是(shì)過硫酸铵？膠聚時(shí)間很長如何解決？
過硫酸铵提供驅動丙烯酰胺和(hé / huò)雙丙烯酰胺聚合所需的(de)自由基，而(ér)TEMED通過催化過硫酸铵形成自由基而(ér)加速它倆的(de)聚合。膠聚合時(shí)間長可能是(shì)TEMED失效了(le／liǎo)，過硫酸铵固體時(shí)間過久也(yě)會失效的(de)。
一(yī / yì ／yí)個(gè)讓PAGE膠很快聚合的(de)方法：
不(bù)要(yào / yāo)先配AP（過硫酸铵）溶液，因爲(wéi / wèi)AP很容易變質。在(zài)保證TEMED和(hé / huò)AP質量的(de)情況下，每次配膠時(shí)，直接稱一(yī / yì ／yí)定量的(de)AP粉劑溶入液體狀态的(de)PAGE中，這(zhè)樣可以(yǐ)保證AP的(de)催化能力，而(ér)且可以(yǐ)多加一(yī / yì ／yí)點。配25ml的(de)PAGE膠，加0.03克AP粉劑，最後加入25ulTEMED，20分鍾左右就(jiù)可以(yǐ)凝固（當然這(zhè)個(gè)時(shí)候拔梳子(zǐ)，會有少量未凝固的(de)PAGE在(zài)孔裏形成絲狀幹擾，使加的(de)樣品看起來(lái)不(bù)太漂亮，但一(yī / yì ／yí)般不(bù)影響跑膠效果和(hé / huò)條帶的(de)形狀和(hé / huò)位置）。
2 DNA電泳的(de)MARKER怎麽是(shì)扭曲的(de)？
1、 配制膠時(shí)的(de)緩沖液需要(yào / yāo)和(hé / huò)電泳緩沖液不(bù)是(shì)同時(shí)配制的(de).最好是(shì)同時(shí)配制.電泳時(shí)緩沖液高過液面1－2mm即可。
2、 電泳時(shí)電壓過高,可以(yǐ)在(zài)電泳前15分鍾用較低電壓(3V/cm),等條帶出(chū)孔後比較漂亮了(le／liǎo).然後再調電壓。
3、 上(shàng)樣時(shí)盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降後再加電壓。
3 跑出(chū)的(de)DNA帶模糊？
1、 DNA降解：避免核酸酶污染。
2、 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用後，離子(zǐ)強度降低，pH值上(shàng)升，緩沖能力減弱，從而(ér)影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。
3、 所用電泳條件不(bù)合适:電泳時(shí)電壓不(bù)應超過20V/cm，溫度＜30℃；巨大(dà)DNA鏈電泳，溫度應＜15℃；核查所用電泳緩沖液是(shì)否有足夠的(de)緩沖能力。
4、 DNA上(shàng)樣量過多：減少凝膠中DNA上(shàng)樣量。
5、 DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉澱去除過多的(de)鹽。
6、 有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。
7、 DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。
4 有不(bù)規則DNA帶遷移?
1、 對于(yú)λ/Hind III片段cos位點複性：電泳前于(yú)65℃加熱DNA 5分鍾，然後在(zài)冰上(shàng)冷卻5分鍾。
2、 電泳條件不(bù)合适：電泳電壓不(bù)超過20V/cm；溫度＜30℃；經常更換電泳緩沖液。
3、 DNA變性：以(yǐ)20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱。
5 跑出(chū)的(de)DNA條帶帶弱或無DNA帶？
1、 DNA的(de)上(shàng)樣量不(bù)夠：增加DNA的(de)上(shàng)樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上(shàng)樣量可适當降低。
2、 DNA降解：避免DNA的(de)核酸酶污染。
3、 DNA走出(chū)凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強凝膠濃度。
4、 對于(yú)EB染色的(de)DNA，所用光源不(bù)合适??應用短波長（254nm）的(de)紫外光源。
6 跑出(chū)的(de)DNA帶缺失不(bù)完整是(shì)怎麽回事?
1、 如果是(shì)小DNA帶走出(chū)凝膠，可以(yǐ)縮短電泳時(shí)間或降低電壓或增強凝膠濃度。
2、 分子(zǐ)大(dà)小相近的(de)DNA帶不(bù)易分辨??增加電泳時(shí)間，核準正确的(de)凝膠濃度。
3、 DNA 變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以(yǐ)20mM NaCl Buffer稀釋DNA。
DNA鏈巨大(dà)，常規凝膠電泳不(bù)合适??在(zài)脈沖凝膠電泳上(shàng)分析。
7 做PCR電泳後跑電泳，目的(de)基因是(shì)489BP的(de)，結果每次切膠回收後再跑電泳就(jiù)變成500多了(le／liǎo)，快到(dào)600了(le／liǎo)？爲(wéi / wèi)什麽？
有時(shí)隻靠電泳結果判斷是(shì)不(bù)準确的(de)，同樣的(de)片段每次跑的(de)遠近會有不(bù)同。有經驗顯示目的(de)片段是(shì)1300多，結果就(jiù)跑到(dào)1000的(de)marker下面去了(le／liǎo)，後來(lái)證實片段沒有問題。也(yě)有做的(de)一(yī / yì ／yí)個(gè)片段也(yě)是(shì)這(zhè)樣，是(shì)490BP.理論上(shàng)兩個(gè)條帶一(yī / yì ／yí)樣，可是(shì)PCR結果顯示就(jiù)是(shì)大(dà)小不(bù)一(yī / yì ／yí)緻。然後回收以(yǐ)後的(de)檢測結果又全部都一(yī / yì ／yí)樣了(le／liǎo)，後來(lái)又拿去做了(le／liǎo)下一(yī / yì ／yí)個(gè)測序，才知道(dào)根本沒有問題。
8 跑完PCR，暫時(shí)不(bù)方便膠回收，條帶已經切下來(lái)放到(dào)ep管裏了(le／liǎo)，這(zhè)個(gè)能保存麽？會不(bù)會有不(bù)良影響？
還有個(gè)問題，pcr的(de)産物可以(yǐ)不(bù)可以(yǐ)直接拿來(lái)做模闆再進行pcr。我試過，可是(shì)總是(shì)出(chū)現一(yī / yì ／yí)個(gè)拖尾亮條，沒有帶，是(shì)什麽原因呢？
割下來(lái)的(de)膠放在(zài)-20保存兩個(gè)星期完全沒有問題。切下來(lái)的(de)膠放在(zài)4度冰箱中4、5小時(shí)沒有問題回收的(de)效果也(yě)很好。
9 凝膠回收DNA實驗的(de)關鍵在(zài)哪裏?
最關鍵的(de)是(shì)切膠之(zhī)後,溶膠的(de)那一(yī / yì ／yí)步.切膠的(de)時(shí)候要(yào / yāo)盡量把多餘的(de)瓊脂糖凝膠切幹淨,按照實驗步驟,第一(yī / yì ／yí)步應該是(shì)将膠充分的(de)溶化.這(zhè)以(yǐ)後步一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)做充分,保證凝膠已經完全溶解了(le／liǎo).加乙醇這(zhè)步也(yě)很關鍵，當凝膠溶解後最好多過幾次柱子(zǐ)。還有就(jiù)是(shì)洗脫的(de)那一(yī / yì ／yí)步。洗脫的(de)時(shí)候最好用加熱到(dào)60度 的(de)洗脫液洗脫，如果實在(zài)效果不(bù)好可以(yǐ)分兩次洗脫。
10 切膠的(de)時(shí)候如何能切的(de)準呢？條帶的(de)位置肉眼很難判斷出(chū)來(lái)，如何判斷條帶的(de)位置呢？
可以(yǐ)将産物與Marker一(yī / yì ／yí)起電泳，染色後，在(zài)紫外燈下觀察結果，跟Marker進行相比，就(jiù)知道(dào)要(yào / yāo)的(de)是(shì)哪條帶。注意，紫外燈下切膠速度要(yào / yāo)快，否則DNA會降解，另外，紫外線對身體傷害很大(dà)，特别是(shì)眼睛，請注意采取保護措施（比如在(zài)專門的(de)箱子(zǐ)裏切，帶眼鏡等）。RNA 用具要(yào / yāo)用10%的(de)NaOH浸泡過液，再用DEPC水沖洗幹淨 70%的(de)乙醇用過 國(guó)産分析乙醇有雜質，RNA酶還會有，并帶入其它污染。