要(yào / yāo)先對PCR目的(de)序列的(de)長度有個(gè)大(dà)緻估計：
第一(yī / yì ／yí)步：找到(dào)Primer3的(de)站點。你不(bù)用記住這(zhè)個(gè)站點，但是(shì)要(yào / yāo)記住“Primer3”這(zhè)個(gè)詞，然後打開GOOGLE首頁，輸入Primer3，跳出(chū)來(lái)的(de)第一(yī / yì ／yí)個(gè)項目就(jiù)是(shì)了(le／liǎo)“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”
網址是(shì)http://frodo.wi.mit.edu/。
第二步：貼上(shàng)模闆序列。進入Primer3站點，可以(yǐ)看到(dào)一(yī / yì ／yí)個(gè)引物設計的(de)界面。在(zài)“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的(de)大(dà)空框裏面把你的(de)模闆序列粘帖進去。注意是(shì)5'->3'方向的(de)，數字或者空格都沒關系，軟件會自動過濾的(de)。
第三步：重要(yào / yāo)參數設定。首先是(shì)“Product Size Ranges”，如果你不(bù)希望軟件給你随便做的(de)話，首先要(yào / yāo)調整的(de)就(jiù)是(shì)這(zhè)個(gè)參數。默認的(de)參數實際上(shàng)是(shì)從100到(dào)1000，這(zhè)個(gè)你得自己改，如果你希望産物的(de)大(dà)小符合你的(de)預期，盡可能把範圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個(gè)參數是(shì)“Primer Size”，默認值一(yī / yì ／yí)般可以(yǐ)用，但是(shì)，當你用熟了(le／liǎo)這(zhè)個(gè)軟件，你自己就(jiù)知道(dào)該怎麽改了(le／liǎo)。第三個(gè)參數是(shì)”Primer Tm”這(zhè)個(gè)和(hé / huò)Primer Size差不(bù)多。
第四步：Pick primers： 點一(yī / yì ／yí)下這(zhè)個(gè)按鈕，符合你大(dà)小預期的(de)primer就(jiù)出(chū)來(lái)了(le／liǎo)，看看Primer3 Output的(de)界面，多麽漂亮！你要(yào / yāo)的(de)primer出(chū)來(lái)了(le／liǎo)，而(ér)且有primer在(zài)序列上(shàng)的(de)位置比對圖，還要(yào / yāo)primer本身的(de)信息，包括位置，長度，Tm，GC含量，任何位置互補堿基數，3'端互補堿基數，以(yǐ)及引物序列，（注意，下遊引物是(shì)5'->3'），還要(yào / yāo)産物大(dà)小，兩引物間任意互補堿基數，兩引物間3'端互補堿基數等。如果引物尚在(zài)參數設定的(de)範圍内，但還不(bù)是(shì)最佳，将會給出(chū)警告。
第五步：引物設計檢驗：可以(yǐ)僅僅設計一(yī / yì ／yí)向引物，隻要(yào / yāo)在(zài)Pick left primer或者Pick right primer前面的(de)勾勾掉一(yī / yì ／yí)個(gè)就(jiù)可以(yǐ)。也(yě)可以(yǐ)自己定義引物，放在(zài)Primer框裏，（注意，下遊引物的(de)書寫反向仍然是(shì)5'->3'）如果符合設定的(de)條件，軟件将對給出(chū)引物評分，同時(shí)給出(chū)警告信息，根據警告信息可以(yǐ)适當對自定義引物做些調整即可，警告信息也(yě)讓你做實驗的(de)時(shí)候心中有數。對于(yú)文獻發表的(de)引物，最好都要(yào / yāo)檢查一(yī / yì ／yí)下，這(zhè)樣就(jiù)可以(yǐ)避免被别人(rén)有意無意誤導。至于(yú)RT-PCR所用的(de)引物，最好是(shì)使得産物跨過内含子(zǐ)，這(zhè)樣避免潛在(zài)DNA對RT-PCR的(de)幹擾。實際做引物的(de)時(shí)候，要(yào / yāo)把内含子(zǐ)都去掉，僅僅把外顯子(zǐ)序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設計的(de)方法，使上(shàng)下遊引物分别全部或者部分落在(zài)不(bù)同外顯子(zǐ)上(shàng)。至于(yú)如何快速識别内含子(zǐ)和(hé / huò)外顯子(zǐ)以(yǐ)及電子(zǐ)PCR，我将抽空另做說(shuō)明。
至于(yú)設計出(chū)來(lái)的(de)引物的(de)實際效果，根據我的(de)經驗，一(yī / yì ／yí)般情況下都能做到(dào)PCR一(yī / yì ／yí)次成功，也(yě)許随便那一(yī / yì ／yí)段序列做引物也(yě)能達到(dào)很好的(de)效果，但是(shì)不(bù)管怎麽說(shuō)，軟件做引物可以(yǐ)讓自己心中有數。最後，GOOD LUCK TO EVERYONE.