1 克隆PCR産物的(de)最優條件是(shì)什麽？
最佳插入片段：載體比需實驗确定。1：1（插入片段：載體）常爲(wéi / wèi)最佳比，摩爾數比1：8或8：1也(yě)行。應測定比值範圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的(de)T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過夜。在(zài)這(zhè)2種溫度下，缺T-凸出(chū)端的(de)載體會自連，産生藍斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大(dà)多數克隆要(yào / yāo)求，爲(wéi / wèi)提高連接效率，需4℃過夜。
2 PCR産物是(shì)否需要(yào / yāo)用凝膠純化？
如凝膠分析擴增産物隻有一(yī / yì ／yí)條帶，不(bù)需要(yào / yāo)用凝膠純化。如可見其他(tā)雜帶，可能是(shì)積累了(le／liǎo)大(dà)量引物的(de)二聚體。少量的(de)引物二聚體的(de)摩爾數也(yě)很高，這(zhè)會産生高比例的(de)帶有引物二聚體的(de)克隆，而(ér)非目的(de)插入片段。爲(wéi / wèi)此需在(zài)克隆前做凝膠純化。
3 如果沒有回收到(dào)目的(de)片段，還需要(yào / yāo)作什麽對照實驗？
A）塗布未轉化的(de)感受态細胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上(shàng)帶有氨苄抗型的(de)質粒，或産生氨苄抗型的(de)菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，将1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于(yú)100ul感受态細胞轉化。用SOC稀釋到(dào)1000ul後，用100ul鋪闆。培養過夜，産生1000個(gè)菌落。轉化率爲(wéi / wèi)： 産生菌落的(de)總數/鋪闆DNA的(de)總量。
鋪闆DNA的(de)總量是(shì)轉化反應所用的(de)量除以(yǐ)稀釋倍數。具體而(ér)言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到(dào)1000u後含10 ngDNA，用1/10鋪闆，共用1 ng DNA。轉化率爲(wéi / wèi)：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪闆1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受态細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受态細胞的(de)轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR産物，産生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受态細胞），表明載體失去T。可能是(shì)連接酶污染了(le／liǎo)核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量标準好無核酸酶污染，不(bù)應用其它來(lái)源的(de)T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受态細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的(de)實驗步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應爲(wéi / wèi)白斑，如産生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。
4 對照實驗結果好，卻沒有回收到(dào)目的(de)片段，實驗出(chū)了(le／liǎo)什麽問題？
A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大(dà)多數克隆，爲(wéi / wèi)提高效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。爲(wéi / wèi)此，将插入片段和(hé / huò)pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了(le／liǎo)對照的(de)菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如産生大(dà)量的(de)藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不(bù)适于(yú)連接。用凝膠純化的(de)插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發生。UV過度照射會産生嘧啶二聚體，不(bù)利于(yú)連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修複功能的(de)耐熱DNA聚合酶的(de)擴增産物末端無A，後者是(shì)pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和(hé / huò)核苷酸可在(zài)末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重複序列可能會不(bù)穩定，在(zài)擴增中産生缺失和(hé / huò)重排，如發現插入片段高頻率地(dì / de)産生缺失和(hé / huò)重排，需用重組缺陷大(dà)腸杆菌菌株，如SURE細胞