1、從柱離心式産品的(de)流行看經典方法的(de)缺點 （或者操作重點）
柱式方法的(de)風行是(shì)無法否定的(de)現實。下面通過柱式方法與經典方法的(de)比較，看一(yī / yì ／yí)看如何注意經典方法的(de)操作重點。
裂解，二者幾乎沒有任何區别。去蛋白質，柱式靠的(de)是(shì)柱材料對蛋白質吸附力低這(zhè)一(yī / yì ／yí)特點，将蛋白質殘留控制在(zài)比較低的(de)水平 (并不(bù)是(shì)/也(yě)不(bù)能徹底去除)；經典方法最常用的(de)是(shì) PC 抽提，可以(yǐ)将蛋白質去除得更徹底一(yī / yì ／yí)些。其它大(dà)分子(zǐ)雜質 - 如多糖等 - 的(de)去除，柱式的(de)與蛋白質的(de)去除相似，但經典方法中卻沒有如此方便的(de)對應方法。小分子(zǐ)物 (鹽等) 的(de)去除，是(shì)柱式方法最優勢所在(zài)。如果柱子(zǐ)設計沒有問題，離心後柱子(zǐ)中殘留的(de)液體穩定而(ér)少；柱式的(de)洗滌具有“流水洗滌”的(de)效果；柱式中的(de)核酸是(shì)不(bù)成團塊的(de) - 這(zhè)三個(gè)特點決定了(le／liǎo)柱式的(de)洗滌效率比經典的(de)洗滌效率高，所以(yǐ)，柱式純化的(de)核酸純度比較高。
2、 應該使用多少菌液？
根據我們的(de)經驗，如爲(wéi / wèi)高拷貝質粒（如：pUC118等），使用2 ml培養液與4 ml培養液純化的(de)質粒DNA的(de)收量差别不(bù)是(shì)很大(dà)，可以(yǐ)純化到(dào)20-25 μg的(de)高純度質粒DNA。如提取地(dì / de)拷貝質粒或大(dà)于(yú)10 kb質粒，建議使用5-10 ml的(de)菌液（可分幾管收集菌體，按比例加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，再将離心上(shàng)清分批轉移至DNA純化柱），吸附和(hé / huò)洗脫的(de)時(shí)間可以(yǐ)适當延長，洗脫時(shí)使用的(de)溶液Eluent應在(zài)60℃水浴預熱。高純度質粒小提試劑盒所配矽膠柱的(de)最大(dà)吸附量是(shì)40 μg，滿足絕大(dà)多數實驗所需用量。
3、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的(de)用量問題
溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的(de)比例是(shì)固定的(de)，如果增加或減少用量都請按比例變化，但是(shì)一(yī / yì ／yí)般來(lái)說(shuō)，用量原則是(shì)确保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的(de)濃度适中（具體表現是(shì)加入溶液Ⅱ後，能形成澄清的(de)裂解溶液）。濃度過低，将導緻沉澱效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質的(de)過程複雜且不(bù)徹底，導緻純度下降。溶液的(de)用量是(shì)以(yǐ)樣品中蛋白質的(de)含量爲(wéi / wèi)基準的(de)，而(ér)不(bù)是(shì)以(yǐ)核酸含量爲(wéi / wèi)基準。
4、 溶液Ⅱ操作時(shí)要(yào / yāo)注意的(de)事項
在(zài)反應液充分的(de)時(shí)候，第一(yī / yì ／yí)，反應的(de)時(shí)間不(bù)能過長，長時(shí)間的(de)堿性條件會打斷DNA，基因組DNA一(yī / yì ／yí)旦發生斷裂，隻要(yào / yāo)是(shì)50－100 kb大(dà)小的(de)片斷，就(jiù)沒有辦法再被溶液Ⅲ沉澱了(le／liǎo)；第二，不(bù)得激烈振蕩，不(bù)然基因組DNA也(yě)會斷裂最後得到(dào)的(de)質粒上(shàng)總會有大(dà)量的(de)基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以(yǐ)觀察到(dào)一(yī / yì ／yí)條濃濃的(de)總DNA條帶。
5、質粒質量檢測
将抽提好的(de)核酸直接用于(yú)後續的(de)實驗，是(shì)唯一(yī / yì ／yí)可靠的(de)檢測方法；除此之(zhī)外的(de)檢測方法，都是(shì)相對的(de)，而(ér)且并不(bù)十分可信。目前用于(yú)正式實驗前檢測核酸質量的(de)方法，一(yī / yì ／yí)是(shì)電泳，二是(shì)紫外分光光度儀。電泳檢測的(de)主要(yào / yāo)是(shì)核酸的(de)完整性和(hé / huò)大(dà)小，隻要(yào / yāo)核酸不(bù)是(shì)太小或者太大(dà) (超出(chū)電泳分離範圍)，該方法還是(shì)非常可信的(de)；電泳還可以(yǐ)用于(yú)估計核酸的(de)濃度，但其準确度與經驗有關；另外，電泳也(yě)可能提供某些雜質污染的(de)信息，但是(shì)同樣與經驗有關。紫外分光光度儀檢測的(de)是(shì)純度和(hé / huò)核酸含量，然而(ér)，由于(yú)紫外分光光度儀不(bù)能确保非常準确，而(ér)該儀器的(de)靈敏度又非常高，所以(yǐ)，提供的(de)結果并不(bù)十分可信。一(yī / yì ／yí)般講，同時(shí)進行紫外和(hé / huò)電泳檢測，綜合二者的(de)結果，可以(yǐ)做出(chū)一(yī / yì ／yí)個(gè)更合理的(de)判斷。但由于(yú)這(zhè)兩個(gè)方法都有缺陷，所以(yǐ)，即使出(chū)現壞的(de)結果能用于(yú)後續實驗而(ér)好的(de)結果卻不(bù)能用于(yú)後續實驗，也(yě)不(bù)用大(dà)驚小怪。
6、 質粒電泳條帶
瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時(shí)，多數情況下你能看到(dào)三條帶，但不(bù)要(yào / yāo)認爲(wéi / wèi)你看到(dào)的(de)是(shì)超螺旋、線性和(hé / huò)開環這(zhè)三條帶。堿法抽提得到(dào)質粒樣品中不(bù)含線性DNA，用EcoRI來(lái)線性化質粒後再進行瓊脂糖電泳，就(jiù)會看到(dào)線性質粒DNA的(de)位置與這(zhè)三條帶的(de)位置不(bù)一(yī / yì ／yí)樣。其實這(zhè)三條帶以(yǐ)電泳速度的(de)快慢而(ér)排序，分别是(shì)超螺旋、開環和(hé / huò)複制中間體（即沒有複制完全的(de)兩個(gè)質粒連在(zài)了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)起）。如果你不(bù)小心在(zài)溶液II加入後過度振蕩，會有第四條帶，這(zhè)條帶泳動得較慢，遠離這(zhè)三條帶，是(shì)20-100kb的(de)大(dà)腸杆菌基因組DNA的(de)片斷。 非常偶然的(de)是(shì)，有時(shí)候抽提到(dào)的(de)質粒會有7－10條帶，這(zhè)是(shì)由于(yú)特殊的(de)DNA序列導緻了(le／liǎo)不(bù)同程度的(de)超螺旋（超螺旋的(de)圈數不(bù)同）所緻。
7、 核酸的(de)保存
純化後的(de)核酸，最後多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以(yǐ)水爲(wéi / wèi)主，DNA 則多以(yǐ)弱堿性的(de) Tris 或者 TE 溶解。經典的(de) DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認爲(wéi / wèi) EDTA 可以(yǐ)減少 DNA 被可能殘留下來(lái)的(de) DNase 降解的(de)風險；如果操作過程控制得當，DNase 的(de)殘留幾乎是(shì)可以(yǐ)忽略的(de)，完全可以(yǐ)直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上(shàng)，核酸在(zài)保存中的(de)穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。
如果溫度合适，保存中核酸發生降解或者消失，首要(yào / yāo)原因是(shì)酶殘留導緻的(de)酶解，第二個(gè)原因則是(shì)保存核酸溶液的(de) pH 值不(bù)合适導緻的(de)水解 (RNA 在(zài)弱酸性更穩定，而(ér) DNA 在(zài)弱堿性更合适)。還有一(yī / yì ／yí)個(gè)不(bù)爲(wéi / wèi)人(rén)重視的(de)，就(jiù)是(shì) EP 管對核酸的(de)影響。首先一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)堅信一(yī / yì ／yí)點，那就(jiù)是(shì)核酸一(yī / yì ／yí)定會與裝它的(de)容器的(de)接觸面發生反應，達到(dào)某種均衡。EP 管的(de)材質，首先可能吸附核酸，其次還可以(yǐ)誘導核酸的(de)結構發生某些變化，如變性。在(zài)核酸的(de)濃度比較高時(shí)，這(zhè)個(gè)現象可能觀察不(bù)到(dào)；當核酸濃度很低時(shí)，則比較明顯了(le／liǎo)。在(zài)低濃度的(de)核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以(yǐ)穩定核酸，雖然已經爲(wéi / wèi)實驗所證明，但許多實驗人(rén)員并沒有将該建議當回事。現在(zài)制造 EP 管的(de)材料遠多于(yú)過去。這(zhè)些新出(chū)現的(de)材料，在(zài)強度、透明度等物理特征方面可能比原來(lái)的(de)純 PP 材質要(yào / yāo)好許多，但其化學特征，尤其是(shì)對核酸穩定性的(de)可能影響，遠沒有研究透徹。正如現在(zài)的(de)質粒可以(yǐ)改造得越來(lái)越适用某些要(yào / yāo)求一(yī / yì ／yí)樣，其負面産物可能是(shì)，抽提的(de)質粒電泳的(de)構型越來(lái)越多：除了(le／liǎo)原來(lái)的(de)三種帶型外，還可能出(chū)現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。
8、 核酸抽提中的(de)溫度問題
核酸抽提中的(de)溫度問題，也(yě)是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)值得關注的(de)問題。首先要(yào / yāo)明确的(de)一(yī / yì ／yí)點是(shì)，任何一(yī / yì ／yí)個(gè)溫度條件，對某些方面有利，同時(shí)也(yě)一(yī / yì ／yí)定會有不(bù)利的(de)一(yī / yì ／yí)面。如沉澱，低溫操作會提高得率，但也(yě)會增加雜質的(de)殘留。任何一(yī / yì ／yí)步操作該用什麽溫度爲(wéi / wèi)好，應該是(shì)利弊權衡的(de)結果。基本上(shàng)，除了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)些特殊的(de)步驟，如消化等外，用室溫是(shì)最好的(de)選擇。低溫的(de)确可以(yǐ)減低酶的(de)活性，但低溫同時(shí)也(yě)降低了(le／liǎo)這(zhè)些酶被裂解液中的(de)試劑滅活或者抑制的(de)速度，此消彼長，沒有辦法給出(chū)結論的(de)。