1、 在(zài)提核酸前，對實驗樣品你應該知道(dào)什麽？
樣品的(de)核酸含量、酶含量、特殊雜質含量。
絕大(dà)情況下，使用新鮮樣品可以(yǐ)獲得最好的(de)結果，但對一(yī / yì ／yí)些雜質含量高的(de)樣品，-20℃保存一(yī / yì ／yí)天後抽提，可能會有更好的(de)效果。樣品如果因爲(wéi / wèi)某些原因必須先行保存，也(yě)要(yào / yāo)先簡化一(yī / yì ／yí)下樣品：血液最好隻保存有核細胞；将樣品分割後保存，避免反複凍融；如果實驗室不(bù)具備合适的(de)保存條件，可将樣品先裂解後再保存。
2、 怎樣選擇裂解方法？
⑴ 含蛋白酶的(de)裂解方法，可以(yǐ)認爲(wéi / wèi)是(shì)抽提基因組 DNA 的(de)首選。某些樣品，如肌肉，即使是(shì) RNA 抽提，也(yě)強烈建議使用含蛋白酶的(de)裂解液 (或者在(zài)操作中的(de)某個(gè)時(shí)候使用蛋白酶消化蛋白質) ，原因在(zài)于(yú)這(zhè)些樣品中的(de)蛋白質，是(shì)非常難以(yǐ)去除的(de)。該方法是(shì)獲得最大(dà)得率和(hé / huò)最高純度的(de)基礎。
⑵ 不(bù)使用蛋白酶的(de)去污劑裂解方法，仍然在(zài)細胞基因組 DNA 抽提方面有優勢，尤其是(shì)當得率和(hé / huò)純度要(yào / yāo)求不(bù)是(shì)最高，而(ér)經濟性及操作簡單很重要(yào / yāo)時(shí)。
① 高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的(de)裂解方法，是(shì)抽提 RNA 的(de)首選。高濃度蛋白質變性劑能快速破壞細胞膜，進而(ér)迅速抑制住細胞内的(de) RNA 酶，從而(ér)确保了(le／liǎo) RNA 的(de)完整性。除了(le／liǎo)極少量不(bù)适用該方法的(de)樣品 – 主要(yào / yāo)是(shì)植物，其它絕大(dà)部分樣品的(de) RNA 的(de)抽提，都可以(yǐ)以(yǐ)高濃度的(de)蛋白質變性劑爲(wéi / wèi)基礎的(de)。該方法也(yě)可用于(yú)基因組 DNA 抽提，非常快速簡單，但純度不(bù)是(shì)很高。
② 含 CTAB 的(de)裂解液，幾乎成爲(wéi / wèi)富含多糖的(de)樣品，如細菌、植物的(de)基因組 DNA 抽提的(de)首選裂解方法。該方法成功與否與兩個(gè)因素有關：一(yī / yì ／yí)是(shì) CTAB 的(de)質量，二是(shì)洗滌的(de)徹底程度。CTAB 的(de)質量對裂解效率有很大(dà)的(de)影響，而(ér)且，似乎還說(shuō)不(bù)清楚原因，因爲(wéi / wèi)即使是(shì)同一(yī / yì ／yí)公司生産的(de)純度一(yī / yì ／yí)樣的(de) CTAB，批号不(bù)同，效果就(jiù)可能差别很大(dà)。洗滌去除 CTAB 要(yào / yāo)比其它的(de)鹽難一(yī / yì ／yí)些，同時(shí)， CTAB 的(de)少量殘留也(yě)會對酶活性有巨大(dà)影響，所以(yǐ)洗滌是(shì)否徹底也(yě)是(shì)該方法成功與否的(de)關鍵。裂解時(shí)的(de)溫度，多使用 65℃；但如果發現降解嚴重或者得率太低，可以(yǐ)試一(yī / yì ／yí)下 37℃ – 45℃ 這(zhè)個(gè)相對低溫的(de)區域。
③ SDS 堿裂解法是(shì)質粒抽提的(de)首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的(de)特點。控制好裂解液/菌體的(de)比例和(hé / huò)操作的(de)溫和(hé / huò)是(shì)該方法成功的(de)關鍵。蛋白質的(de)沉澱效率在(zài) 4℃會更好一(yī / yì ／yí)些，所以(yǐ)，加入溶液 III 後在(zài)4℃靜置一(yī / yì ／yí)段時(shí)間以(yǐ)及采用4℃離心去蛋白質，都可以(yǐ)提高質量。該方法不(bù)一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)使用 PC 純化，但結合 PC 純化，可以(yǐ)獲得純度很高的(de)質粒。RNA 的(de)去除可以(yǐ)靠在(zài)溶液 I 中加入 RNase A (100μg/ml) 或者在(zài)最後的(de)溶解液中加入 RNase A (25 μg/ml) 來(lái)實現。總的(de)感覺是(shì)，在(zài)溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的(de)殘留少一(yī / yì ／yí)些。不(bù)過，經典沉澱幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大(dà)質粒 (50 kb 以(yǐ)上(shàng))，該方法可能會有問題。
3、 不(bù)同純化方法之(zhī)間有什麽不(bù)同？
⑴ PC 抽提/醇沉澱方法，是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)永不(bù)過時(shí)的(de)方法。穩定、可靠、經濟、方便。PC 抽提可以(yǐ)徹底去除蛋白質，醇沉澱可以(yǐ)去除鹽，對于(yú)一(yī / yì ／yí)般的(de)幹淨的(de)樣品 (雜質爲(wéi / wèi)蛋白質)，該方法完全可以(yǐ)獲得高質量的(de)核酸。PC 抽提的(de)關鍵是(shì)，一(yī / yì ／yí)要(yào / yāo)混勻徹底，二要(yào / yāo)用量足夠。徹底混勻，才能确保苯酚與蛋白質的(de)充分接觸，使蛋白質完全變性。許多人(rén)總是(shì)擔心混勻的(de)劇烈程度是(shì)否會對核酸，尤其是(shì)基因組 DNA 造成破壞，實際上(shàng)大(dà)可不(bù)必如此小心。劇烈的(de)混勻操作，是(shì)會部分打斷大(dà)分子(zǐ)的(de)基因組 DNA，但該破壞作用不(bù)會強烈到(dào) DNA 變成 10kb 以(yǐ)内的(de)小片段。手劇烈晃動混勻後，基因組 DNA 的(de)片段，大(dà)部分會大(dà)于(yú) 20kb，這(zhè)個(gè)大(dà)小，除了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)些特别的(de)要(yào / yāo)求外，對 PCR 和(hé / huò)酶切，都是(shì)完全适用的(de)。如果要(yào / yāo)求的(de)片段非常大(dà)，如構建文庫用，則不(bù)能使用劇烈的(de)混勻方法，而(ér)隻能來(lái)回溫和(hé / huò)颠倒混勻──此時(shí)的(de)關鍵是(shì)：裂解液的(de)比例要(yào / yāo)足夠大(dà)，使體系不(bù)要(yào / yāo)太粘稠。用量要(yào / yāo)足夠，是(shì)因爲(wéi / wèi)苯酚去除蛋白質是(shì)有一(yī / yì ／yí)定的(de)飽和(hé / huò)度的(de)，超過了(le／liǎo)該飽和(hé / huò)度，裂解體系中的(de)蛋白質不(bù)會被一(yī / yì ／yí)次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的(de)壞處是(shì)，蛋白質難以(yǐ)徹底去除，以(yǐ)及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以(yǐ)要(yào / yāo)注意裂解液與樣品的(de)比例。PC 抽提的(de)另外一(yī / yì ／yí)個(gè)用途是(shì)，利用酸性酚可以(yǐ)部分去除 DNA 的(de)特點，在(zài) RNA 抽提時(shí)獲得 DNA 殘留極少的(de) RNA。不(bù)過有一(yī / yì ／yí)點要(yào / yāo)提醒的(de)是(shì)，有些植物樣品，在(zài)去除某些雜質之(zhī)前，是(shì)不(bù)能使用 PC 抽提的(de)，否則核酸必定降解。總之(zhī)，該方法的(de)最大(dà)的(de)問題是(shì)不(bù)适合大(dà)規模抽提。
⑵ 高鹽沉澱蛋白質/醇沉澱方法，與 PC 抽提方法相比，除了(le／liǎo)純度的(de)穩定性可能要(yào / yāo)低一(yī / yì ／yí)點外，該方法幾乎克服了(le／liǎo) PC 抽提的(de)所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質所伴随的(de)好處是(shì)，可以(yǐ)用于(yú)大(dà)規模抽提，不(bù)足是(shì)純度 (蛋白質殘留) 不(bù)夠穩定。蛋白質的(de)沉澱效率在(zài) 4℃會更好一(yī / yì ／yí)些。
⑶ 介質純化方法，是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)越來(lái)越受到(dào)重視的(de)方法。其最大(dà)特點是(shì)非常适合大(dà)規模核酸抽提，并且因爲(wéi / wèi)受人(rén)爲(wéi / wèi)操作因素影響小，純度的(de)穩定性很高 (雖然純度不(bù)一(yī / yì ／yí)定比PC 純化方法更高)。其緻命弱點是(shì)樣品過量。介質可以(yǐ)分爲(wéi / wèi)兩大(dà)類，一(yī / yì ／yí)類是(shì)柱式的(de)，即介質被預先裝填在(zài)下面是(shì)通的(de)柱子(zǐ)裏；另外一(yī / yì ／yí)類則是(shì)顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的(de)介質的(de)純化操作與經典的(de)醇沉澱差别不(bù)大(dà)，都是(shì)通過數次的(de)加液-倒液過程，幹燥後，溶解即可獲得純化好的(de)核酸。柱式純化的(de)操作雖然也(yě)是(shì)有加液-倒液過程，但因爲(wéi / wèi)加入的(de)液體通過離心後會進入另外一(yī / yì ／yí)個(gè)離心管中，與含有核酸的(de)柱子(zǐ)完全是(shì)分開的(de)，所以(yǐ)洗滌更徹底，操作更省力 (不(bù)用操心将核酸倒掉了(le／liǎo)，或者液體的(de)殘留)。不(bù)過，介質純化方法的(de)成本是(shì)最高的(de)，而(ér)目前核酸純化試劑盒也(yě)多爲(wéi / wèi)此方法。
4、 醇的(de)沉澱
⑴ 醇的(de)沉澱，目的(de)是(shì)使核酸從裂解體系中沉澱下來(lái)，從而(ér)實現核酸與其它雜質 – 主要(yào / yāo)是(shì)鹽 – 的(de)分離。實際操作中，許多雜質也(yě)會與核酸一(yī / yì ／yí)起被醇沉澱下來(lái)，尤其是(shì)當其它雜質的(de)濃度也(yě)比較高的(de)時(shí)候。醇的(de)沉澱并不(bù)是(shì)非常特異性的(de)，任何有機大(dà)分子(zǐ)及一(yī / yì ／yí)些鹽，當濃度達到(dào)一(yī / yì ／yí)定水平後，都可能同步被沉澱下來(lái)。如果核酸抽提的(de)起始樣品是(shì)比較“髒”的(de)，原則上(shàng)不(bù)要(yào / yāo)使用低溫沉澱。低溫沉澱能提高沉澱效率：當核酸濃度很低時(shí)，效果明顯；當核酸濃度比較高時(shí)，效果不(bù)明顯，但卻會導緻雜質的(de)大(dà)大(dà)增加。TRIzol 提供的(de)一(yī / yì ／yí)個(gè)沉澱方案：一(yī / yì ／yí)半異丙醇加一(yī / yì ／yí)半高鹽溶液替代純粹的(de)異丙醇，可以(yǐ)大(dà)大(dà)降低多糖殘留。
⑵ PEG、LiCl、CTAB 都可以(yǐ)用于(yú)核酸沉澱。雖然它們遠沒有醇沉澱的(de)高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以(yǐ)沉澱 RNA 以(yǐ)去除 DNA，CTAB 可以(yǐ)從含多糖的(de)裂解體系中将核酸沉澱下來(lái)。PEG 是(shì)沉澱病毒顆粒的(de)方便手段。
5、 怎樣去洗滌沉澱？
洗滌首先一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)将沉澱懸浮起來(lái)；第二就(jiù)是(shì)要(yào / yāo)有一(yī / yì ／yí)定的(de)時(shí)間，尤其是(shì)當核酸沉澱比較大(dà)時(shí) (使核酸沉澱最終蓬松)；第三是(shì)少量多次；第四則是(shì)去上(shàng)清要(yào / yāo)徹底。教科書中的(de)操作基本上(shàng)都是(shì)“倒掉上(shàng)清後倒置在(zài)吸水紙上(shàng)片刻”，這(zhè)一(yī / yì ／yí)描述本身沒有問題，且十分方便，但因爲(wéi / wèi)他(tā)來(lái)自國(guó)外，自然就(jiù)有了(le／liǎo)“水土不(bù)服”的(de)問題。如果離心管是(shì)經過矽化的(de)，因爲(wéi / wèi)液體幾乎不(bù)挂壁，所以(yǐ)上(shàng)清可以(yǐ)去除得非常徹底；好的(de)管子(zǐ)，即使沒有經過矽化，殘留量也(yě)非常少，也(yě)沒有什麽問題；差的(de)管子(zǐ)，液體的(de)挂壁非常可觀，其殘留量多到(dào)會影響後續的(de)實驗。唯一(yī / yì ／yí)不(bù)受管子(zǐ)質量影響的(de)操作，就(jiù)是(shì)倒掉液體後再短暫離心，将殘液用移液器吸出(chū)。一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)牢記的(de)是(shì)，殘液中都含有上(shàng)一(yī / yì ／yí)步操作中的(de)雜質，其殘留量與混勻程度、核酸沉澱的(de)大(dà)小都有關。揮發時(shí)去掉的(de)是(shì)乙醇，雜質是(shì)不(bù)會被揮發去除的(de)。另外，核酸沉澱的(de)大(dà)小及裂解液的(de)裂解能力也(yě)決定了(le／liǎo)洗滌的(de)強度。沉澱越大(dà)，裂解液的(de)裂解能力越強，洗滌越要(yào / yāo)徹底：放置時(shí)間相對要(yào / yāo)長一(yī / yì ／yí)點，洗滌次數也(yě)要(yào / yāo)考慮增加。最關鍵的(de)，洗滌一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)用室溫的(de) 75% 乙醇。
6、 怎樣保存核酸？
純化後的(de)核酸，最後多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以(yǐ)水爲(wéi / wèi)主，DNA 則多以(yǐ)弱堿性的(de) Tris 或者 TE 溶解。經典的(de) DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認爲(wéi / wèi) EDTA 可以(yǐ)減少 DNA 被可能殘留下來(lái)的(de) DNase 降解的(de)風險；如果操作過程控制得當，DNase 的(de)殘留幾乎是(shì)可以(yǐ)忽略的(de)，完全可以(yǐ)直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上(shàng)，核酸在(zài)保存中的(de)穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。如果溫度合适，保存中核酸發生降解或者消失，首要(yào / yāo)原因是(shì)酶殘留導緻的(de)酶解，第二個(gè)原因則是(shì)保存核酸溶液的(de) pH 值不(bù)合适導緻的(de)水解 (RNA 在(zài)弱酸性更穩定，而(ér) DNA 在(zài)弱堿性更合适)。還有一(yī / yì ／yí)個(gè)不(bù)爲(wéi / wèi)人(rén)重視的(de)，就(jiù)是(shì) EP 管對核酸的(de)影響。首先一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)堅信一(yī / yì ／yí)點，那就(jiù)是(shì)核酸一(yī / yì ／yí)定會與裝它的(de)容器的(de)接觸面發生反應，達到(dào)某種均衡。EP 管的(de)材質，首先可能吸附核酸，其次還可以(yǐ)誘導核酸的(de)結構發生某些變化，如變性。在(zài)核酸的(de)濃度比較高時(shí)，這(zhè)個(gè)現象可能觀察不(bù)到(dào)；當核酸濃度很低時(shí)，則比較明顯了(le／liǎo)。如抽提的(de)質粒電泳的(de)構型越來(lái)越多，除了(le／liǎo)原來(lái)的(de)三種帶型外，還可能出(chū)現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。在(zài)低濃度的(de)核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以(yǐ)穩定核酸，雖然已經爲(wéi / wèi)實驗所證明，但許多實驗人(rén)員并沒有将該建議當回事。
7、 核酸質量檢測
将抽提好的(de)核酸直接用于(yú)後續的(de)實驗，是(shì)唯一(yī / yì ／yí)可靠的(de)檢測方法；除此之(zhī)外的(de)檢測方法，都是(shì)相對的(de)，而(ér)且并不(bù)十分可信。目前用于(yú)正式實驗前檢測核酸質量的(de)方法，一(yī / yì ／yí)是(shì)電泳，二是(shì)紫外分光光度儀。電泳檢測的(de)主要(yào / yāo)是(shì)核酸的(de)完整性和(hé / huò)大(dà)小，隻要(yào / yāo)核酸不(bù)是(shì)太小或者太大(dà) (超出(chū)電泳分離範圍)，該方法還是(shì)非常可信的(de)；電泳還可以(yǐ)用于(yú)估計核酸的(de)濃度，但其準确度與經驗有關；另外，電泳也(yě)可能提供某些雜質污染的(de)信息，但是(shì)同樣與經驗有關。紫外分光光度儀檢測的(de)是(shì)純度和(hé / huò)核酸含量，然而(ér)，由于(yú)紫外分光光度儀不(bù)能确保非常準确，而(ér)該儀器的(de)靈敏度又非常高，所以(yǐ)，提供的(de)結果并不(bù)十分可信。一(yī / yì ／yí)般講，同時(shí)進行紫外和(hé / huò)電泳檢測，綜合二者的(de)結果，可以(yǐ)做出(chū)一(yī / yì ／yí)個(gè)更合理的(de)判斷。但由于(yú)這(zhè)兩個(gè)方法都有缺陷，所以(yǐ)，即使出(chū)現壞的(de)結果能用于(yú)後續實驗而(ér)好的(de)結果卻不(bù)能用于(yú)後續實驗，也(yě)不(bù)用大(dà)驚小怪。