1 PCR産物的(de)電泳檢測時(shí)間
一(yī / yì ／yí)般爲(wéi / wèi)48h以(yǐ)内，有些最好于(yú)當日電泳檢測，大(dà)于(yú)48h後帶型不(bù)規則甚緻消失。
2 假陰性，不(bù)出(chū)現擴增條帶，應該怎麽辦？
PCR反應的(de)關鍵環節有①模闆核酸的(de)制備，②引物的(de)質量與特異性，③酶的(de)質量及用量， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上(shàng)述環節進行分析研究。
3 出(chū)現假陽性怎麽辦？
出(chū)現的(de)PCR擴增條帶與目的(de)靶序列條帶一(yī / yì ／yí)緻，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不(bù)合适：選擇的(de)擴增序列與非目的(de)擴增序列有同源性，因而(ér)在(zài)進行PCR擴增時(shí)，擴增出(chū)的(de)PCR産物爲(wéi / wèi)非目的(de)性的(de)序列。靶序列太短或引物太短，容易出(chū)現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增産物的(de)交叉污染：這(zhè)種污染有兩種原因：一(yī / yì ／yí)是(shì)整個(gè)基因組或大(dà)片段的(de)交叉污染，導緻假陽性。這(zhè)種假陽性可用以(yǐ)下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止将靶序列吸入加樣槍内或濺出(chū)離心管外。除酶及不(bù)能耐高溫的(de)物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭等均應一(yī / yì ／yí)次性使用。必要(yào / yāo)時(shí)，在(zài)加标本前，反應管和(hé / huò)試劑用紫外線照射，以(yǐ)破壞存在(zài)的(de)核酸。二是(shì)空氣中的(de)小片段核酸污染，這(zhè)些小片段比靶序列短，但有一(yī / yì ／yí)定的(de)同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出(chū)PCR産物，而(ér)導緻假陽性的(de)産生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
4 出(chū)現非特異性擴增帶怎麽辦？
PCR擴增後出(chū)現的(de)條帶與預計的(de)大(dà)小不(bù)一(yī / yì ／yí)緻，或大(dà)或小，或者同時(shí)出(chū)現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的(de)出(chū)現，其原因：一(yī / yì ／yí)是(shì)引物與靶序列不(bù)完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是(shì)Mg2+離子(zǐ)濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是(shì)酶的(de)質和(hé / huò)量，往往一(yī / yì ／yí)些來(lái)源的(de)酶易出(chū)現非特異條帶而(ér)另一(yī / yì ／yí)來(lái)源的(de)酶 則不(bù)出(chū)現，酶量過多有時(shí)也(yě)會出(chū)現非特異性擴增。其對策有：必要(yào / yāo)時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換另一(yī / yì ／yí)來(lái)源的(de)酶。降低引物量，适當增加模闆量，減少循環次 數。适當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
4.1 怎樣檢測引物是(shì)否合成的(de)好？
可以(yǐ)在(zài)DHPLC上(shàng)看一(yī / yì ／yí)下，80度全變性的(de)情況下一(yī / yì ／yí)條帶就(jiù)可以(yǐ)了(le／liǎo)。如果合成的(de)不(bù)好，産物自然不(bù)特異了(le／liǎo)。
4.2 使用了(le／liǎo)比較好的(de)Taq酶，且引物沒有出(chū)現問題，考慮如下幾點：
1。模闆是(shì)否過量？
2。退火溫度是(shì)否可降高1－2度？
3。Mg的(de)濃度控制在(zài)1.5mM?
5 出(chū)現片狀拖帶或塗抹帶怎麽辦？
PCR擴增有時(shí)出(chū)現塗抹帶或片狀帶或地(dì / de)毯樣帶。其原因往往由于(yú)酶量過多或酶的(de)質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一(yī / yì ／yí)來(lái)源的(de)酶。②減少dNTP的(de)濃度。适當降低Mg2+濃 度。增加模闆量，減少循環次數。