DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix 實驗方案 1
針對猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的(de)定性實時(shí)聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測：
1. 研究背景與目的(de)
- 猴痘病毒（MPXV）是(shì)正痘病毒屬（Orthopoxvirus, OPXV）的(de)一(yī / yì ／yí)種，自天花根除以(yǐ)來(lái)，已成爲(wéi / wèi)由OPXV引起的(de)最嚴重疾病。
- 2022年全球猴痘疫情的(de)爆發促使需要(yào / yāo)增加臨床測試的(de)診斷能力。
- 研究目的(de)是(shì)驗證一(yī / yì ／yí)種定性的(de)OPXV實時(shí)PCR檢測方法，并描述其在(zài)臨床實驗室診斷MPXV的(de)分析性能。
2. 材料與方法
2.1 分析性能實驗材料
- 使用含有合成MPXV DNA的(de)通用轉運介質（UTM）或病毒轉運介質（VTM）進行實驗。
2.2 DNA提取
- 使用核酸提取儀器進行自動化核酸提取。
2.3 實時(shí)TaqMan PCR檢測
- 總反應體積：20 µL（包含5 µL的(de)模闆和(hé / huò)15 µL的(de)主混合液）。
- 主混合液成分：
- 5 µL DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix （GDSBio, V5005）。
- 7 µL dH2O。
- 1 µL 正向引物（10 nm）。
- 1 µL 反向引物（10 nm）。
- 1 µL 探針（5 nm），針對OPXV目标序列。
- 臨床樣本測試：當加入内控時(shí)，dH2O的(de)體積減少至4 µL，以(yǐ)允許加入1 µL的(de)正向和(hé / huò)反向引物（各10 nm）和(hé / huò)探針（5 nm），針對人(rén)類RNAseP基因。
- 實時(shí)PCR操作：使用Prism 7500序列檢測系統（Applied Biosystems），并按照以(yǐ)下循環條件進行：
- 1個(gè)循環：95.0°C持續2分鍾。
- 40個(gè)循環：95.0°C持續3秒，60.0°C持續31秒。
在(zài)這(zhè)項實驗中，實時(shí)PCR是(shì)用來(lái)檢測和(hé / huò)定量猴痘病毒DNA的(de)。使用的(de)TaqMan化學方法是(shì)一(yī / yì ／yí)種常用的(de)熒光定量PCR技術，它可以(yǐ)在(zài)PCR擴增過程中實時(shí)監測DNA的(de)累積量。通過這(zhè)種方式，可以(yǐ)準确測定病毒DNA的(de)濃度，從而(ér)幫助診斷猴痘病毒感染。
以(yǐ)下是(shì)實驗中使用的(de)引物和(hé / huò)探針序列：
1. OPXV目标的(de)引物和(hé / huò)探針序列：
- 正向引物(F): `TCAACTGAAAAGGCCATCTATGA`
- 反向引物(R): `GAGTATAGAGCACTATTTCTAAATCCCA`
- 探針(P): `FAM-CCATGCAATATACGTACAAGATAGTAGCCAAC`
2. 人(rén)類RNAseP基因作爲(wéi / wèi)内控的(de)引物和(hé / huò)探針序列：
- 正向引物(F): `AGATTTGGACCTGCGAGCG`
- 反向引物(R): `GAGCGGCTGTCTCCACAAGT`
- 探針(P): `Cy5–TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG`
3. 首月測試中得到(dào)的(de)陽性患者樣本也(yě)在(zài)内部使用基于(yú)研究的(de)猴痘特異性PCR進行了(le／liǎo)檢測，使用的(de)引物和(hé / huò)探針序列（針對B6R基因）：
- 正向引物(F): `ATTGGTCATTATTTTTGTCACAGGAACA`
- 反向引物(R): `AATGGCGTTGACAATTATGGGTG`
- 探針(P): `FAM-AGAGATTAGAAATA`
2.4 檢測限（LOD）
- 通過将MPXV DNA稀釋至不(bù)同濃度并檢測，确定LOD。
2.5 可重複性
- 使用100個(gè)拷貝/mL的(de)MPXV陽性樣本和(hé / huò)陰性UTM/VTM評估可重複性。
2.6 特異性
- 測試已知陽性患者樣本，包括單純疱疹病毒1型、2型等，以(yǐ)确定特異性。
2.7 一(yī / yì ／yí)緻性
- 使用88個(gè)盲樣（包括陰性和(hé / huò)不(bù)同濃度的(de)陽性樣本）進行測試。
這(zhè)個(gè)實驗方案詳細地(dì / de)描述了(le／liǎo)從樣本收集、核酸提取、實時(shí)PCR檢測到(dào)結果分析的(de)全過程。
DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix
貨号：V5005，V5006
産品簡介
DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix是(shì)用于(yú)一(yī / yì ／yí)步法多重熒光定量PCR的(de)試劑。它以(yǐ)探針和(hé / huò)特異性引物來(lái)定量檢測RNA或DNA靶标序列。優化的(de)緩沖液組分可以(yǐ)協助在(zài)一(yī / yì ／yí)個(gè)體系内完成多達4個(gè)RNA或DNA序列的(de)多重定量PCR。該混合液以(yǐ)4倍濃度提供，能夠加入更多的(de)模闆進行反應，從而(ér)提高檢測的(de)靈敏度。
産品用途
探針法多重基因表達分析
産品特點
全預混，使用方便
可同時(shí)檢測多個(gè)靶标
高靈敏度，檢測低拷貝基因
耐受臨床樣本抑制劑
含防污染系統，減少交叉污染