Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 實驗方案 1
多克隆瘧原蟲株系中特定單倍型藥物反應表型的(de)剖析：
1. 實驗材料和(hé / huò)試劑準備
- 選擇3個(gè)疑似多克隆的(de)P. falciparum株系，例如：IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)。
- 準備O+型人(rén)類紅細胞和(hé / huò)RPMI 1640培養基，以(yǐ)及所需的(de)補充劑和(hé / huò)抗生素。
- 準備氯喹、甲氟喹和(hé / huò)哌拉喹藥物儲備溶液。
- 準備用于(yú)DNA提取、基因分型和(hé / huò)PCR反應的(de)相關試劑。
2. 瘧原蟲株系的(de)體外培養
- 使用标準體外培養條件，将瘧原蟲株系在(zài)37°C、5% CO2和(hé / huò)90% N2氣氛下培養。
3. 多克隆性質的(de)确認
- 提取每個(gè)瘧原蟲株系的(de)DNA，并在(zài)24個(gè)高度多态性SNP位點進行基因分型。
4. 單一(yī / yì ／yí)寄生蟲譜系的(de)分離
- 通過限制稀釋法，将瘧原蟲株系在(zài)96孔闆中進行稀釋，以(yǐ)分離單個(gè)受感染的(de)紅細胞。
- 使用SYBR® Green I熒光染料檢測寄生蟲DNA，确定陽性孔。
5. 基因分型和(hé / huò)系統發育分析
- 對每個(gè)陽性孔中的(de)寄生蟲進行基因分型，使用24-SNP分子(zǐ)條形碼法。
- 構建系統發育樹，分析不(bù)同寄生蟲譜系之(zhī)間的(de)關系。
6. 體外抗瘧藥敏感性測試
- 使用SYBR® Green Antimalarial Assay對氯喹、甲氟喹和(hé / huò)哌拉喹的(de)敏感性進行測試。
- 測定每種藥物的(de)半最大(dà)抑制濃度（IC50）。
7. 寄生蟲存活試驗
- 對于(yú)CQ和(hé / huò)PPQ，使用環階段存活試驗(RSA)和(hé / huò)哌拉喹存活試驗(PSA)來(lái)确定寄生蟲對藥物的(de)存活率。
8. 抗瘧藥抗性位點的(de)測序和(hé / huò)基因分型
8.1 目标基因的(de)選擇
選擇已知與抗瘧藥抗性相關的(de)基因，包括但不(bù)限于(yú)：
- 氯喹抗性相關基因：pfcrt（瘧原蟲氯喹抗性轉運蛋白）
- 甲氟喹和(hé / huò)哌拉喹抗性相關基因：pfmdr-1（瘧原蟲多藥耐藥1基因）
- 蒿甲醚抗性相關基因：K13基因
8.2 DNA提取和(hé / huò)PCR擴增
- 使用DNA提取試劑盒從瘧原蟲培養物中提取基因組DNA。
- 設計特異性引物，針對上(shàng)述基因進行PCR擴增。例如，使用五組引物覆蓋整個(gè)pfcrt基因。
8.3 SNPs檢測
- 使用Sanger測序技術對PCR産物進行測序，以(yǐ)檢測pfcrt、pfmdr-1和(hé / huò)K13基因中的(de)單核苷酸多态性（SNPs）。
- 利用測序結果分析軟件（如DNASTAR Lasergene）進行序列數據的(de)分析和(hé / huò)可視化。
8.4 拷貝數變異檢測
- 使用ΔΔCT方法确定pfmdr-1和(hé / huò)pfmp-2（瘧原蟲血漿膜蛋白2基因）的(de)拷貝數，這(zhè)些基因與甲氟喹和(hé / huò)哌拉喹抗性相關。
- 通過實時(shí)定量PCR（qPCR）技術，在(zài)同一(yī / yì ／yí)孔中同時(shí)擴增目标基因和(hé / huò)内參基因（如β-微管蛋白基因或絲氨酸tRNA連接酶基因）。
8.5 qPCR實驗操作
- 準備主混合液，包含Multiplex Probe qPCR Mix Plus U （GDSBio, P2701）、無菌水、目标基因和(hé / huò)内參基因的(de)預配方Taqman SNP檢測。
- 将主混合液分配到(dào)96孔PCR闆中，每個(gè)樣本包含75 ng的(de)寄生蟲DNA。
- 使用CFX96實時(shí)PCR儀器進行樣品擴增，并使用基因表達模塊分析結果。
8.6 數據分析
- 将目标基因的(de)拷貝數與内參基因的(de)拷貝數進行比較，以(yǐ)确定相對拷貝數。
- 使用已知拷貝數的(de)标準樣品（如3D7株系）進行校準。
- 對于(yú)pfmdr-1和(hé / huò)pfmp-2基因，分析是(shì)否存在(zài)基因擴增現象，這(zhè)可能與抗藥性發展有關。
8.7 結果記錄和(hé / huò)解釋
- 記錄所有測序和(hé / huò)qPCR結果，包括基因型和(hé / huò)拷貝數。
- 解釋測序和(hé / huò)拷貝數變異數據，分析它們與體外抗藥性表型之(zhī)間的(de)潛在(zài)聯系。
8.8 質量控制
- 包括使用已知基因型的(de)實驗室控制株系作爲(wéi / wèi)陽性和(hé / huò)陰性對照。
- 對每個(gè)實驗步驟進行重複，以(yǐ)确保數據的(de)準确性和(hé / huò)可重複性。
以(yǐ)上(shàng)步驟提供了(le／liǎo)詳細的(de)實驗流程，用于(yú)檢測和(hé / huò)分析與抗瘧藥抗性相關的(de)基因變異。實驗操作應嚴格遵守實驗室規程和(hé / huò)生物安全指南，确保數據的(de)準确性和(hé / huò)可靠性。
9. 數據分析
- 使用GraphPad Prism軟件分析IC50值和(hé / huò)存活率數據。
- 應用統計方法比較不(bù)同寄生蟲譜系之(zhī)間的(de)差異。
10. 結果解釋和(hé / huò)報告
- 解釋實驗結果，讨論不(bù)同寄生蟲譜系的(de)抗藥性表型。
- 撰寫實驗報告，包括實驗方法、結果和(hé / huò)讨論。
11. 安全性和(hé / huò)質量控制
- 确保實驗操作符合生物安全标準。
- 使用已知的(de)實驗室控制株系作爲(wéi / wèi)陽性和(hé / huò)陰性對照。
12. 實驗材料的(de)保存和(hé / huò)記錄
- 記錄所有實驗步驟和(hé / huò)結果。
- 保存所有原始數據和(hé / huò)實驗材料，以(yǐ)備後續分析和(hé / huò)驗證。
這(zhè)個(gè)實驗方案提供了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)個(gè)全面的(de)框架，用于(yú)研究P. falciparum株系的(de)多克隆性和(hé / huò)抗藥性表型。實驗操作應嚴格遵守實驗室規程和(hé / huò)生物安全指南。
Multiplex Probe qPCR Mix Plus U
貨号：P2701，P2702，P2703，P2704
産品簡介
Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 是(shì)用于(yú)探針法實時(shí)定量 PCR 的(de) 2×濃縮預混液，使用時(shí) 隻需加入模闆、引物和(hé / huò)探針即可進行反應。本品含有抗體技術修飾的(de)熱啓動酶 Hotstart Taq DNA 聚合酶，配合東盛特制的(de) Real Time PCR Buffer，不(bù)僅有效抑制引物二聚體和(hé / huò)其他(tā)非 特異性擴增，而(ér)且能夠提高擴增效率，可以(yǐ)進行多重探針 qPCR 反應。該試劑引入 了(le／liǎo) dUTP/UDG 防污染系統，可以(yǐ)在(zài) PCR 反應前清除含 dUTP 的(de) PCR 産物，有效避免因 擴增産物的(de)交叉污染對定量的(de)影響。本品方便用于(yú)制備 IVD 分子(zǐ)診斷試劑盒，對靶基因定 量準确、可信度高，重複性好。本品可搭配 TaqMan 等各類熒光探針使用，與常見定量 PCR 儀完美兼容，如 ABI、Roche、Bio-Rad 等。
産品用途
探針法基因表達分析
多重低拷貝基因檢測
産品特點
可進行多重探針法熒光定量PCR
适合常見定量機型
高效熱啓動技術帶來(lái)高特異和(hé / huò)可重複的(de)擴增
含 dUTP/UDG 防污染系統
穩定性高，适合大(dà)規模檢測